Die thermoresponsive C22-Phagensteifigkeit moduliert die Phageninfektiosität

Nov 27, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 13001 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bakteriophagen bieten eine nachhaltige Alternative zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten. Aufgrund des Mangels an Kenntnissen über die Mechanismen der Phageninfektion ist die biologische Kontrolle auf Phagenbasis jedoch unterschiedlich und unwirksam. In dieser Arbeit haben wir die Temperaturabhängigkeit der Infektion und das thermoresponsive Verhalten des C22-Phagen untersucht. Dieses bodenbürtige Podovirus ist in der Lage, Ralstonia solanacearum zu lysieren und so eine bakterielle Welkekrankheit zu verursachen. Wir haben gezeigt, dass der C22-Phage die pathogene Wirtszelle besser infizieren kann, wenn er bei niedrigen Temperaturen (25, 30 °C) inkubiert wird als bei hohen Temperaturen (35, 40 °C). Die Messung der C22-Phagensteifigkeit ergab, dass die Phagensteifigkeit bei niedrigen Temperaturen zwei- bis dreimal größer war als bei hohen Temperaturen. Darüber hinaus zeigten die Bildgebungsergebnisse, dass bei niedrigen Temperaturen mehr C22-Phagenpartikel an der Zelloberfläche hafteten als bei hohen Temperaturen, was die Phagensteifigkeit und die Phagenanhaftung in Zusammenhang bringt. Das Ergebnis legt nahe, dass die Struktur- und Steifigkeitsmodulation als Reaktion auf Temperaturänderungen die Infektion verbessert und mechanistische Einblicke in den Lysezyklus des C22-Phagen bietet. Unsere Studie zeigt die Notwendigkeit, die Reaktionen der Phagen auf die schwankende Umgebung zu verstehen, um eine wirksame Umsetzung der phagenbasierten Biokontrolle zu ermöglichen.

Die durch Ralstonia solanacearum verursachte bakterielle Welkekrankheit hat Nutzpflanzen wie Kartoffeln, Tomaten, Tabak und Chili zerstört, was etwa 1 Milliarde US-Dollar pro Jahr kostet1. Konventionelle Praktiken wie Bodendesinfektion, Bodenverbesserung und Fruchtwechsel sind arbeitsintensiv und ineffektiv, da pathogene Bakterien lange Zeit im Boden überleben und sich über Wasserkanäle in nahegelegene Regionen ausbreiten können2,3. Der Einsatz von Chemikalien und Pestiziden zur Beseitigung der Bakterien führt zu schädlichen Rückständen auf Verbrauchsgütern, der menschlichen Gesundheit und der Umwelt. Daher hat die biologische Bekämpfung von Welkekrankheiten durch Ralstonia solanacearum mit antagonistischen Mitteln als sichere Alternative an Interesse gewonnen4,5. Unter diesen Wirkstoffen zeigen lytische Bakteriophagen oder Phagen vielversprechende Ergebnisse bei der Bekämpfung solcher schädlichen Bakterien6,7,8,9. Phagen zielen auf bestimmte Bakterienzellen des Wirts ab. Sobald alle Wirtszellen ausgerottet sind, werden die Phagen nicht mehr repliziert. Phagen gelten allgemein als sicher (GRAS) und ungiftig für Eukaryoten, was sie zu einer attraktiven Wahl für die Vorbeugung und Behandlung von Pflanzenkrankheiten, einschließlich der bakteriellen Welkekrankheit, macht10,11.

Trotz der Vorteile von Phagen wird die phagenvermittelte Biokontrolle aufgrund ihrer unterschiedlichen Wirksamkeit nur unzureichend genutzt12,13,14,15. Der Erfolg der Phagen-Biokontrolle hängt von der Infektion der bakteriellen Wirtszelle durch Phagen ab, die von mehreren umgebenden Faktoren wie pH-Wert, Ionen und osmotischem Druck gesteuert wird16,17,18. Ein Einflussfaktor in allen Mikroumgebungen ist die Temperatur. Bei der Biokontrolle eingesetzte Phagen unterliegen aufgrund des täglichen Klimas und saisonaler Schwankungen auf den landwirtschaftlichen Feldern ständig schwankenden Temperaturen. Die Temperaturabhängigkeit von Phagen wurde bereits zuvor untersucht. Die genaue Rolle der Temperatur bei der Phageninfektion bleibt jedoch unklar. Einige Phagen können bei ihren spezifischen zulässigen Temperaturen besser infizieren19,20,21,22. Lambda-Phagen, die Escherichia coli infizieren, und die Phagen, die Burkholderia pseudomallei infizieren, infizierten ihre Wirtszellen wirksamer und produzierten bei etwa 35–40 °C mehr Nachkommenphagen als bei etwa 20–35 °C20,22. Die Zelllysestudie von Pseudomonas fluorescens durch den ɸS1-Phagen zeigte eine höhere Infektionsrate bei 26 °C als bei 37 °C23. Andererseits sind einige Phagen temperaturunempfindlich. Der T4-Myovirus-Phage lysierte E. coli BL21 effektiv in einem Temperaturbereich von 15 bis 41 °C24. Der P100-Phage, der Listeria monocytogenes infizierte, blieb bei 4–60 °C infektiös25,26. Der MR5-Phage, der Pseudomonas syringae infiziert und Bakterienkrebs verursacht, zeigte bei 20, 27 und 37 °C eine ähnliche Infektiosität27. Das Verständnis, wie sich die Temperatur auf die Phageninfektion auswirkt, kann in Verbindung mit Temperaturprognosedaten und Infektionen einen Leitfaden für den Einsatz von Phagen-Biokontrollen liefern6,28. Daher versuchen wir, die Rolle der Temperatur für Phagen im Biokontrolleinsatz zu entschlüsseln.

Der Einfluss der Temperatur auf die Phageninfektion wird dadurch reguliert, wie strukturelle Komponenten von Phagen molekular auf Temperaturänderungen reagieren. Der A511-Phage infizierte Listeria monocytogenes und war bei hohen Temperaturen (60–80 °C) stabiler als der P100-Phage, was auf den etwas höheren Schmelzpunkt des Schwanzkapsid-Verbindungsproteins des A511-Phagen zurückzuführen ist25. Eine Studie am T7-Phagen zeigte, dass hohe Temperaturen die Phageninfektion des Wirtsschwanzes verringerten, da die hohe Temperatur das Abbrechen des Phagenschwanzes vom Phagenkapsid verursachte29. Einige Studien deuten darauf hin, dass eine Temperaturerhöhung die Infektion verbessert, da dadurch mehr Wärmeenergie bereitgestellt wird, um das Genom in die Wirtszellen zu befördern30,31,32. Das Verständnis der molekularen Wechselwirkungen innerhalb von Phagenproteinen und -strukturen als Reaktion auf thermische Veränderungen enthüllt den zugrunde liegenden Mechanismus der Phageninfektion und des Überlebens. Daher sind Erkenntnisse auf molekularer Ebene erforderlich, um den Einfluss der Temperatur zu verstehen, was maßgeschneiderte Richtlinien für die Verwendung von Phagen als Biokontrollmittel liefern wird.

In dieser Arbeit haben wir die Rolle der Temperatur auf einen lytischen C22-Phagen und seine Infektion aufgezeigt. Das aus einer Bodenprobe in Thailand isolierte C22-Podovirus kann das pathogene Bakterium Ralstonia solanacearum (Rs) lysieren und bei Tomaten und Paprika eine bakterielle Welkekrankheit verursachen33. Die Krankheit zerstört auch andere Nachtschattengewächse wie Kartoffeln, Tabak und Auberginen, was zu einem weltweiten Verlust von einer Milliarde US-Dollar pro Jahr führt34. Der C22-Phage stellt daher einen vielversprechenden und dringend benötigten antibakteriellen Wirkstoff gegen die bakterielle Welkekrankheit dar. Wir haben den Temperatureffekt auf den C22-Phagen mithilfe eines Plaque-basierten Infektiositätstests untersucht. Wir fanden heraus, dass der auf 25–30 °C erhitzte C22-Phage die Wirtszelle um etwa 44 % besser infizieren kann als der C22-Phage, der bei 35–40 °C inkubiert wurde. Wir untersuchten den direkten Einfluss der Temperatur, indem wir die bei verschiedenen Temperaturen inkubierten C22-Phagenpartikel mithilfe von auf Rasterkraftmikroskopie (AFM) basierenden Techniken untersuchten. AFM verwendet einen Ausleger mit einer nanometergroßen Spitze, um die schwach an einer glatten Oberfläche haftenden Phagenpartikel zu streicheln. Es ist keine chemische Modifikation oder Färbung der Phagenpartikel erforderlich, die einige Partikeldetails beeinträchtigen oder deren Eigenschaften beeinträchtigen könnte35,36,37. Wir haben die Bilder der C22-Phagen aufgenommen und die Phagensteifigkeit mit AFM-basierter Nanoeinkerbung in einem flüssigen Milieu bei verschiedenen Temperaturen gemessen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Phagensteifigkeit eine entscheidende Rolle bei der Phagenbindung an der Oberfläche der Wirtszelle spielen könnte. Da sich die Phagensteifigkeit aus der strukturellen Integrität des Phagenpartikels ergibt, deuten unsere Ergebnisse auf die thermoresponsive Beziehung zwischen Phagenstruktur und -funktion im Lysezyklus hin, die für die praktische Phagenverwendung gründlich verstanden werden muss.

Wir untersuchten den Temperatureffekt auf die Infektiosität des C22-Phagen mithilfe eines Plaque-basierten Infektiositätstests (Plaque-Assay) mit einer leichten Modifikation38. In unserem modifizierten Plaque-Assay wurde der C22-Phage 30 Minuten lang bei vier Temperaturen (25, 30, 35 und 40 °C) inkubiert, bevor er mit den Rs-Zellen gemischt und auf CPG-Medium-Agar inkubiert wurde. Nach der Inkubation über Nacht wurde die Anzahl der klaren Zonen oder Plaques, die auf eine erfolgreiche Lyse von Bakterienzellen durch Phagen schließen lassen, als Plaque-bildende Einheit pro Phagenvolumen (PFU/ml) aufgezeichnet, was als Titer bezeichnet wird. Die Phagentiter bei 25, 30, 35 und 40 °C wurden gesammelt und durch den bei 25 °C aufgezeichneten durchschnittlichen Phagentiter auf 100 % normalisiert. Der Temperaturbereich in unserer Studie deckte eine Temperaturschwankung ab, die der C22-Phage auf den landwirtschaftlichen Feldern in Thailand aushalten muss39,40.

Die normalisierten Titer (Abb. 1) zeigten mit steigender Temperatur insgesamt einen abnehmenden Trend. Bei einem Temperaturanstieg von 25 auf 30 °C sanken die Titer leicht um etwa 10 % (siehe Ergänzungstabelle S1). Die Titer sanken schnell um etwa 44 %, wenn die Temperatur von 30 auf 35 °C stieg. Als schließlich die Temperatur von 35 auf 40 °C stieg, blieben die Titer relativ ähnlich. Das Ergebnis zeigte, dass die 30-minütige Inkubation eine gewisse Veränderung der C22-Phagenprobe verursachte und zu einer Veränderung der Infektiosität führte. Daher haben wir weiter untersucht, wie der C22-Phage während der Inkubation bei jeder Temperatur beeinflusst worden sein könnte.

Relative Titer des C22-Phagen bei 25, 30, 35 und 40 °C. Die Titermessung wurde dreifach durchgeführt und der Fehlerbalken stellte Standardabweichungen (SD) dar.

Einige Eigenschaften des C22-Phagen können während der Inkubationszeit thermisch verändert oder induziert werden, was zu einer Abnahme des Titers führt. Wir untersuchten daher die C22-Phagenpartikel bei 25, 30, 35 und 40 °C mithilfe von AFM-basierten Techniken in einem MES-Puffermilieu. Das AFM erfasste einen 16 µm2 großen Bereich, der mehr als 10 Phagenpartikel enthielt. Die Phagenpartikel wurden wie folgt gezählt und kategorisiert. Einzeln abgetrennte Partikel wurden in die Kategorie „dispergiert“ gezählt. Die Ansammlungen von 2 oder mehr anhaftenden Partikeln wurden in der Kategorie „Aggregation“ gezählt. Die Zählungen in jeder Kategorie wurden auf ihre Gesamtpartikelzahl normiert, die bei jeder Temperatur mindestens 1000 Partikel betrug (ergänzende Abbildung S1). Die AFM-Bilder der C22-Phagenpartikel bei vier Temperaturen zeigten, dass die meisten C22-Phagenpartikel (> 90 %) dispergiert waren und nur ein kleiner Teil (< 10 %) der Partikel aggregierte (Ergänzende Abbildung S2; Tabelle S2).

Aufgrund eines geringeren Bewegungsgrades besteht bei aggregierten Phagenpartikeln eine geringere Wahrscheinlichkeit, dass sie mit den Wirtszellen kollidieren und sich daran festsetzen, als bei dispergierten Partikeln. Infolgedessen kann die Phagenaggregation zu einer verringerten Infektion der Wirtszellen führen41,42. Die Analyse der AFM-Bilder zeigte, dass sich der Großteil der Phagenpartikel verteilte. Dieses Ergebnis impliziert, dass die meisten C22-Phagenpartikel, die bei jeder Temperatur inkubiert wurden, für die Bindung und Interaktion mit den Wirtszellen verfügbar waren. Die Dispersion und Aggregation des C22-Phagen bei vier Temperaturen war quantitativ ähnlich. Daher war es unwahrscheinlich, dass die Aggregation zu einer im Plaque-Assay beobachteten verringerten Infektiosität führte. Die verringerte Infektion kann stattdessen durch die Veränderung der Eigenschaften einzelner Phagenpartikel verursacht werden.

Die Struktur der C22-Phagenpartikel im MES-Puffer bei 25, 30, 35 und 40 °C wurde mit der berührungslosen AFM-Bildgebungsmethode erfasst und analysiert. Die AFM-Daten und die Analyse zeigten, dass das C22-Phagenpartikel bei den vier Temperaturen intakt und morphologisch ähnlich blieb. Ein beispielhaftes AFM-Bild des C22-Phagen in MES-Puffer bei 25 °C (Abb. 2a) zeigte eine Ikosaederform mit einem Durchmesser von etwa 40 nm (Abb. 2b). Die bei kleinen Phagenpartikeln beobachtete Winkelcharakteristik machte sich beim C22-Phagen bemerkbar43,44. Bei genauer Betrachtung der Phagenstruktur bei vier Temperaturen wurden keine strukturellen Schäden oder Zerfälle der Phagenpartikel beobachtet (ergänzende Abbildung S3). Der durchschnittliche Durchmesser der C22-Phagenpartikel war bei vier Temperaturen ungefähr gleich (Abb. 2c; Ergänzungstabelle S3), was darauf hindeutet, dass die C22-Phagenpartikel nicht schrumpfen oder anschwellen. Daher sind strukturelle Schäden oder Instabilität des Phagenpartikels keine Ursache für die Abnahme der Infektiosität.

Die Größe eines mittels AFM untersuchten C22-Phagenpartikels. (a) AFM-Bild eines C22-Phagenpartikels im MES-Puffer bei 25 °C. Die Farbverlaufsskalenleiste zeigt die Höhe (Z-Richtung) an. Der orangefarbene Einschub zeigte eine ikosaedrische Form. (b) Der Partikeldurchmesser wurde aus dem Partikelquerschnitt extrahiert (weiße gestrichelte Linie). (c) Der durchschnittliche Durchmesser der C22-Phagenpartikel bei 25, 30, 35 und 40 °C betrug etwa 40 nm. Die Fehlerbalken stellten Standardabweichungen (sd) von 50 Partikeln dar.

Obwohl die C22-Phagenpartikel morphologisch ähnlich waren, können sich andere strukturelle Eigenschaften der Phagenpartikel innerhalb von 25–40 °C dennoch ändern. Deshalb verwendeten wir einen anderen AFM-basierten Ansatz namens Nanoindentation, um die dynamischen Veränderungen der Phagenpartikel zu untersuchen. Bei diesem Ansatz wurde das Partikel eingedrückt und die mechanischen Eigenschaften des Phagen wie Steifheit und Bruchkraft gemessen. Solche Eigenschaften sind mit kritischen Schritten im viralen Lebenszyklus verbunden, wie etwa der Genomverpackung45,46, dem Genomtransfer47,48 und der Kapsidstabilität29,49. In dieser Studie wurde die Steifheit des C22-Phagenpartikels in MES-Puffer bei 25, 30, 35 und 40 ° C extrahiert und aus Kraft-Abstandskurven des Phagenpartikels und des Glimmers berechnet (ergänzende Abbildung S4). Die Verteilungen der Phagensteifigkeit bei 25, 30, 35 und 40 °C wurden aus 50 bis 60 Phagensteifigkeitswerten bei jeder Temperatur generiert. Die Verteilungen wurden durch Normalverteilung angepasst, um die repräsentative Steifheit des C22-Phagen zu ermitteln (Abb. 3). Die Steifheit des C22-Phagen zeigte mit steigender Temperatur einen abnehmenden Trend (Abb. 4). Die Phagensteifigkeit war bei 30 °C (0,065 ± 0,01 N/m) etwas geringer als bei 25 °C (0,071 ± 0,01 N/m). Die Phagensteifigkeit nahm bei 35 °C um etwa 55 % ab (0,029 ± 0,01 N/m). Die Phagensteifigkeit blieb bei 40 °C relativ unbeeinflusst (0,028 ± 0,01 N/m). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Abnahme der Steifheit mit der verringerten Infektion des C22-Phagen zusammenhängen könnte, die durch den modifizierten Plaque-Assay beobachtet wurde.

Diagramme der Steifigkeitsverteilungen des C22-Phagen in MES-Puffer bei 25 (a), 30 (b), 35 (c) und 40 °C (d). Die gestrichelten grauen Linien stellten die Normalverteilung dar, wobei die Zentren (graue Pfeile) die Phagensteifigkeit bei jeder Temperatur darstellten.

Die Steifheit des C22-Phagen nahm mit zunehmender Temperatur von 25 auf 40 °C ab. Die Fehlerbalken stellten die Standardabweichung (SD) dar.

Es bleibt eine offensichtliche Frage: Wie trägt die Abnahme der Phagensteifigkeit zur verminderten Infektiosität bei? Um diese Frage zu beantworten, untersuchten wir, wie der C22-Phage bei verschiedenen Temperaturen mit der Wirtszelle interagierte. Nach 30-minütiger Inkubation bei jeder Temperatur wurde der C22-Phage mit den Wirtszellen mit der gleichen Infektionsmultiplizität wie in der Plaque-Infektiositätsstudie gemischt. Die Mischung wurde mit AFM-Bildgebung untersucht.

Die Größe einer Rs-Zelle (Abb. 5a) wurde mit einer Länge von etwa 1,8 µm und einer Breite von 0,9 µm gemessen. Bei der Untersuchung der Mischung aus C22-Phagen und Zellen stellten wir fest, dass die an der Zelloberfläche gebundenen Phagenpartikel deutlich erkennbar waren (Abb. 5b, e Einschübe). Die Bindung des C22-Phagen an die Zelloberfläche lässt darauf schließen, dass sich die potenziellen Rezeptoren auf der Zelloberfläche befinden. Bei den Kandidatenrezeptoren handelt es sich um Transmembranproteine ​​oder Moleküle, die aus der Zelloberfläche austreten (z. B. Lipopolysaccharid)31,50. Wir fanden auch die unterschiedliche Anzahl der an der Zelloberfläche anhaftenden C22-Phagenpartikel. Bei 25 und 30 °C waren viele C22-Phagenpartikel an der Zelloberfläche gebunden (Abb. 5b, c), aber bei 35 und 40 °C waren nur wenige C22-Phagenpartikel an der Zelloberfläche gebunden (Abb. 5d, e). Je mehr Phagenpartikel an der Wirtszelle haften, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Zelle vom Phagen infiziert wird. Die Daten deuten darauf hin, dass der bei 25 und 30 °C inkubierte C22-Phage die Wirtszelle wirksamer infizieren könnte als bei 35 und 40 °C. Die Daten stimmen auch mit dem Ergebnis des Plaque-Assays überein, das eine Verbesserung der Infektion bei 25 und 30 °C zeigte. In Kombination mit dem Ergebnis der Phagensteifigkeit schlagen wir vor, dass die relativ starren C22-Phagenpartikel bei 25 und 30 °C besser an die Zelloberfläche binden und die Wirtszelle infizieren könnten als die relativ weichen C22-Phagenpartikel bei 35 und 40 °C.

Beispielhafte AFM-Bilder der C22-Phagen- und Rs-Zellen bei verschiedenen Temperaturen. (a) Ein AFM-Bild einer Rs-Zelle ohne den C22-Phagen. Der bei 25 °C (b), 30 °C (c), 35 °C (d) und 40 °C (e) inkubierte C22-Phage gemischt mit Rs-Zellen wurde mittels AFM untersucht. Einzelne C22-Phagenpartikel konnten in (b,e)-Einschüben unterschieden werden. Der Farbverlaufsskalenbalken war die Skala der vertikalen Amplitude (Z-Richtung). Die weißen Maßstabsbalken in den (a–e)-Feldern hatten eine Größe von 500 nm und die im Einschub hatten eine Größe von 100 nm.

In dieser Arbeit fanden wir heraus, dass die Infektion der Rs-Zellen durch den C22-Phagen abnahm, wenn wir den C22-Phagen bei steigenden Temperaturen von 25 auf 40 °C inkubierten. Die Temperatur muss innerhalb dieses Temperaturbereichs zu einigen Veränderungen der C22-Phagenpartikel führen, was zu einer abnehmenden Infektiosität führt. Bei der Untersuchung waren die Phagenpartikel größtenteils nicht aggregiert, sodass eine Aggregation als wahrscheinliche Ursache für eine verringerte Infektion ausgeschlossen werden konnte. Weitere Untersuchungen einzelner Phagenpartikel ergaben, dass die Partikel bei Inkubation bei steigenden Temperaturen keine morphologischen Veränderungen zeigten; Allerdings wurde die Steifigkeit der Partikel verringert. Eine Erhöhung der thermischen Energie könnte die lokale Schwingung von Kapsidproteinen und DNA verstärken, wodurch die attraktive Wechselwirkung zwischen Kapsomeren und doppelsträngigen (ds) DNA-Strängen geschwächt und somit die Steifheit verringert würde51. Frühere Computerstudien deuteten darauf hin, dass virale Kapside mit steigender Temperatur einen „Fluiditätsübergang“ durchlaufen könnten52. Bei diesem Übergang überschreitet die durchschnittliche Trennung zwischen Kapsomeren einen bestimmten Schwellenwert, was eine größere Flexibilität des Kapsids und eine geringere Steifheit zum Ausdruck bringt. Eine Verringerung der Steifheit dicht gepackter dsDNA kann auch eine Rolle bei der verringerten Phagensteifigkeit aufgrund eines Übergangs der dsDNA im Inneren viraler Kapside von fest zu flüssig spielen32,48. Mit steigender Temperatur wurde die DNA-Struktur ungeordneter und zeigte eine geringere Steifigkeit. Insgesamt erfahren das C22-Phagenkapsid und die interne dsDNA wahrscheinlich ähnliche Übergänge, was zur verringerten Steifheit beiträgt.

Wir vermuteten, dass die abnehmende Steifheit die Infektion der Rs-Zelle regulierte. Die Entdeckung, dass die abnehmende Steifigkeit mit der verringerten Anzahl an an der Zellmembran haftenden Phagenpartikeln zusammenhängt, bestärkte unsere Hypothese. Mit anderen Worten: Die thermisch induzierte abnehmende Steifigkeit des C22-Phagenpartikels behindert die Bindungswirksamkeit und verringert so die Infektion der Wirtszelle durch den C22-Phagen. Der Befund drängt uns dazu, die Rolle der Phagensteifigkeit bei der Phagenbindung im Infektionszyklus zu untersuchen. Ein klassisches Modell der Phagenadsorption zeigt, dass die Bindung durch die Erkennung zwischen den Phagenschwanzfasern oder -spitzen und dem Wirtszellrezeptor initiiert wird53,54. Die Phagensteifigkeit geht aufgrund ihrer Häufigkeit hauptsächlich auf das Kapsidprotein und die intern verpackte dsDNA zurück32,45,55,56. Daher kann der Effekt der Phagensteifigkeit von den Kapsidproteinen und der DNA ausgehen und sich auf die Faser- und Spike-Proteine ​​ausbreiten. Wir nehmen an, dass Portalproteine ​​diese vorgeschlagene mechanistische Verbreitung bewirken könnten57,58. Es hat sich gezeigt, dass diese dynamische Struktur, die das Kapsid-DNA-Ensemble und die Schwanzproteine ​​verbindet, flexibel ist und sich wie ein mechanischer Sensor verhält, der die gesamte strukturelle Veränderung erkennt59,60. Ein Phagenpartikel mit höherer Steifigkeit lässt auf eine kompaktere Kapsidstruktur und eine dichter gepackte DNA schließen61. Eine solche Struktur kann einen kleineren intermolekularen Abstand aufweisen und wiederum die strukturellen Veränderungen mechanisch besser verbreiten als ein Phagenpartikel mit geringerer Steifigkeit. So kann beispielsweise die Bewegung von Schwanzfasern oder Stacheln beim Binden gefördert werden. Der DNA-Auswurf kann durch die Ausbreitung der Pfortaderproteinverlängerung oder -kompression besser bei einer höheren Steifheit als bei Phagenpartikeln mit niedrigerer Steifheit vorangetrieben werden62,63. Die genauen Mechanismen auf molekularer Ebene erfordern weitere Strukturstudien, die in zukünftigen Arbeiten weiterverfolgt werden.

Darüber hinaus kann die Temperatur durch zusätzliche Mechanismen die Phageninfektiosität beeinflussen. Die Temperatur kann Konformationsänderungen hervorrufen oder Faser- und Spike-Proteine ​​schädigen und deren Eigenschaften (z. B. Flexibilität) und die Virusbindung beeinträchtigen19,64. Die Temperatur kann auch die stochastische Bewegung der Phagenpartikel erhöhen und so die Bindungs- und Freisetzungsereignisse zwischen den Phagenbindungsproteinen und den Wirtszellrezeptoren beeinflussen65,66. Die Temperatur kann die Expression von Genen oder Proteinen beeinflussen, die am Infektionsprozess beteiligt sind67,68. Das Ausmaß des Temperatureffekts auf Strukturkomponenten ist jedoch aufgrund der vorübergehenden Natur der Phagen-Wirt-Wechselwirkung unklar.

In unserer jüngsten Studie variierte die Steifheit des C22-Phagen mit unterschiedlichem pH-Wert und unterschiedlicher Ionenstärke, die Adsorptionseffizienz blieb jedoch relativ konstant35. Die AFM-Ergebnisse dieser Studie zeigten etwas anderes. Bei steigender Temperatur verringerte sich die Anzahl der C22-Phagenpartikel im Adsorptionsschritt, was mit der abnehmenden Steifigkeit der C22-Phagenpartikel in Verbindung gebracht werden kann. Diese Diskrepanz ist wahrscheinlich auf die zur Untersuchung der Phagenadsorption verwendeten Methoden zurückzuführen. Die vorherige Studie stützte sich auf die Menge der nicht adsorbierten Phagenpartikel im Überstand nach der Ausfällung der Phagen-adsorbierten Zellen. Dieser experimentelle Ansatz untersuchte die Adsorption der Phagenpartikel auf der Zelloberfläche nicht direkt. In dieser Studie haben wir die C22-Phagenbindung an der Wirtszelle direkt visualisiert, was eine tatsächliche Ansicht der In-situ-Bindungsereignisse mit höherer Auflösung und Genauigkeit ermöglicht.

Die Dynamik der Virussteifheit resultiert aus der molekularen Anpassung des Viruspartikels, um dessen Infektionswahrscheinlichkeit zu maximieren. Die Steifigkeitsmodulation hängt wahrscheinlich vom Virustyp und damit von den reagierenden Strukturkomponenten ab. Unsere vorherige Studie hat gezeigt, dass die hohe Infektiosität des C22-Phagen mit seiner mittleren Steifheit zusammenhängt. Das winzige Virus von Mäusen entspannte die Kapsomere an der Kapsid- und Kapsomer-Schwanz-Portal-Verbindung, was zu einer geringeren mechanischen Versteifung und einer verbesserten Infektion führte69. Lambda-Phage und Herpes-simplex-Virus Typ 1 förderten den DNA-Transfer in Wirtszellen, indem sie die DNA-Steifheit verringerten32,48,70,71. Das humane Immundefizienzvirus reduzierte seine Membransteifigkeit durch Reifung, um den Zelleintritt zu verbessern72. Daher kann die Steifigkeitsregulierung als Rückkopplungsmechanismus für Viren angesehen werden, um sich an Überleben und Replikation anzupassen.

Unsere Ergebnisse verdeutlichen die thermoresponsiven strukturellen und nanomechanischen Aspekte des Phagen-Lyse-Zyklus, die für den praktischen Einsatz von Phagen im Pflanzenkrankheitsmanagement gründlich verstanden werden müssen. Das Verständnis der C22-Phageninfektion wird es uns ermöglichen, zu entwickeln, wie der C22-Phage auf Feldern mit schwankenden Temperaturen in Biokontrollanwendungen effektiv eingesetzt werden sollte. Beispielsweise sollten Landwirte den C22-Phagen in Zeiten mit niedrigeren Temperaturen (25–30 °C) verwenden, da die Infektiosität des C22-Phagen wahrscheinlich abnimmt, wenn die Temperatur 35–40 °C erreicht. Das Wissen dieser Studie und die Verfügbarkeit von Präzisionslandwirtschaftstechnologien wie Bodentemperatursensoren und IoT werden den Landwirten helfen, den Umweltstatus zu überwachen und die Phagen-Biokontrolle angemessen durchzuführen28,73.

Eine Übernachtkultur des Ralstonia solanacearum-Stammes RS3/1-1 (Rasse 1, Biovar 4) bei 28 °C und 230 U/min unter Schütteln wurde mit frischem CPG-Medium, das 0,1 % (Gew./Vol.) Casaminosäuren, 1 % ( w/v) Pepton und 0,5 % (w/v) Glucose. Die Reinigung des C22-Phagen wurde an anderer Stelle beschrieben35. Das C22-Phagenpellet wurde im MES-Puffer, bestehend aus 0,05 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure oder MES (Sigma-Aldrich), pH 6,0, 0,1 M NaCl und 0,05 M MgSO4, resuspendiert und bei 4 °C gelagert35,74.

Eine Übernachtkultur des Rs-Stamms RS3/1-1 bei 28 °C und 230 U/min Schütteln wurde mit frischem CPG-Medium auf eine OD600 von 0,25 verdünnt. Im ersten Fall (inkubierter Phagen) wurden 100 μl des C22-Phagen in MES-Puffer bei jeder Temperatur (25, 30, 35, 40 °C) 30 Minuten lang inkubiert. Danach wurden 10 μL der inkubierten Phagensuspension mit 250 μL verdünnter Rs-Kultur gemischt. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurde die Mischung mit geschmolzenem 0,45 % Agar in einem CPG-Medium versetzt und auf eine CPG-Platte mit 1,5 % Agar gelegt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 28 °C wurde die Anzahl der Plaques aufgezeichnet. Der Plaque-Assay wurde dreifach durchgeführt.

Glimmer (Sorte V1, Ted Pella) wurde separat mit zwei Chemikalien beschichtet. Die erste Chemikalie war eine Poly-L-Lysin (PLL)-Lösung (Sigma-Aldrich). Ein Glimmer wurde gespalten und 15 Minuten lang in einer 0,1 %igen (Gew./Vol.) PLL-Lösung inkubiert. Der Glimmer wurde mit entionisiertem Wasser gespült und mit Stickstoffgas getrocknet. Zur Immobilisierung von Rs-Zellen wurde ein PLL-beschichteter Glimmer verwendet. Die zweite Chemikalie war (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTS) (Sigma-Aldrich). Ein Glimmer wurde gespalten und in einer 1 % APTS-Lösung in entionisiertem Wasser unter Schütteln bei 50 U/min 15 Minuten lang inkubiert. Der Glimmer wurde mit entionisiertem Wasser gespült und mit Stickstoffgas getrocknet. Zur Immobilisierung der C22-Phagenpartikel wurde ein APTS-beschichteter Glimmer verwendet.

Für die Rs-Zell-AFM-Bildgebung wurde der C22-Phage bei jeder Temperatur (25, 30, 35, 40 °C) 30 Minuten lang inkubiert. Der inkubierte Phagen wurde dann 30 Minuten lang mit der Rs-Zelle gemischt und anschließend 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem PLL-beschichteten Glimmer inkubiert. Danach wurden die immobilisierten Zellen auf dem Glimmersubstrat mit entionisiertem Wasser gewaschen und mit Stickstoffgas getrocknet. AFM-Bildgebungsmessungen wurden mit einem NanoWizard 3 BioScience AFM (JPK-Bruker) durchgeführt. Die Bilder wurden im berührungslosen Modus (AC-Modus) unter Umgebungsbedingungen aufgenommen. Während der Bildgebung oszillierte der AFM-Ausleger (ACTA-Modell, AppNano) mit einer nanometergroßen Spitze am Ende, während der Ausleger die Probenoberfläche (die X- und Y-Achsen) abtastete. Die Reaktionsschwingungsamplitude in der vertikalen (Z)-Achse wurde als Amplitudenbilder der Probenoberfläche aufgezeichnet.

Für die C22-Phagen-AFM-Bildgebung und Nanoeinkerbung wurde ein 100-μl-Tröpfchen des C22-Phagen in MES-Puffer mit (~ 1012 pfu/ml) bei jeder Temperatur (25, 30, 35, 40 °C) 30 Minuten lang inkubiert. Ein 50-μl-Tropfen der inkubierten Phagensuspension wurde vor dem AFM-Experiment 30 Minuten lang mit dem APTS-behandelten Glimmersubstrat inkubiert. Die mit einem digitalen Thermometer (421TK, Ponpe Instruments) überprüfte Temperatur der AFM-Probe wurde mit einer Heizstufe (PetriDish Heater, JPK-Bruker) bei jeder Temperatur konstant gehalten. Bilder des C22-Phagen wurden im berührungslosen Modus (AC-Modus) aufgenommen. Die Steifheit der Phagenpartikel wurde im Kraftspektroskopiemodus des AFM gemessen. Es wurde ein BioLever mini BL-AC40TS-C2 (Olympus) Cantilever mit einer durch thermische Abstimmung ermittelten Federkonstante von 0,02–0,14 N/m verwendet. Kurz gesagt, die Kraft-Distanz-Kurve (FD) zeichnete die Einkerbung der AFM-Spitze in den Mittelbereich des Phagenpartikels auf. Die aus dem linearen Bereich der FD-Kurven auf dem Partikel und dem Glimmer extrahierten Steigungen wurden anhand der Federkonstante oder Steifigkeit des Phagenpartikels berechnet (ergänzende Abbildung S3). Die Berechnungsdetails wurden an anderer Stelle beschrieben32,45,45,75.

Bei jeder Temperatur (25, 30, 35, 40 °C) wurden 50–60 Steifigkeitswerte von 15 bis 20 Phagenpartikeln gemessen, um eine Steifigkeitsverteilung zu erzeugen. Eine Gaußsche Funktion (Normalverteilung) wurde mithilfe der normalen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion, einer Open-Source-Software in Python76, an die empirische Steifigkeitsverteilung angepasst. Das Peakzentrum, das die Phagensteifigkeit darstellt, und die Standardabweichung (sd) wurden aus der Anpassung extrahiert. Die Standardabweichung wurde dann zum Standardfehler (sem) der Steifigkeit75,77 berechnet. Alle Handlungsfiguren im Manuskript wurden von der Mathplotlib-Bibliothek in Python78 generiert.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seiner ergänzenden Informationsdatei enthalten.

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Diese Forschung wurde vom NSRF über die Program Management Unit for Human Resources & Institutional Development, Research, and Innovation (Fördernummer B16F640116) finanziell unterstützt. Thailand Research Fund (Fördernummer TRG6280009); und National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Thailand (Projektnummer P21-51892). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten, beim Verfassen des Manuskripts oder bei der Entscheidung zur Veröffentlichung der Ergebnisse.

Nationales Zentrum für Gentechnik und Biotechnologie (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Pathum Thani, 12120, Thailand

Udom Sae-Ueng, Anjana Bhunchoth, Namthip Phironrit, Orawan Chatchawankanphanich, Ubolsree Leartsakulpanich & Penchit Chitnumsub

National Nanotechnology Centre (NANOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Pathum Thani, 12120, Thailand

Alongkot Treetong & Chaweewan Sapcharoenkun

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Alle Autoren haben die Experimente konzipiert. US, AB, NP, AT und CS führten die Experimente durch. USA, OC, UL und PC analysierten die Ergebnisse. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Udom Sae-Ueng.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sae-Ueng, U., Bhunchoth, A., Phironrit, N. et al. Die thermoresponsive C22-Phagensteifigkeit moduliert die Phageninfektiosität. Sci Rep 12, 13001 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16795-y

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Eingegangen: 23. April 2022

Angenommen: 15. Juli 2022

Veröffentlicht: 29. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16795-y

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